Wissenschaftliche Studie zu Phytexponent

Präklinische Wirksamkeit (Entzündung & Schmerz) und Sicherheit (in vitro)

Phytexponent wird in der Komplementär- und Alternativmedizin zur Behandlung von Schmerzen und Entzündungen eingesetzt. Empirische Daten zu seiner pharmakologischen Wirksamkeit und Sicherheit sind jedoch spärlich, weshalb die vorliegende Studie durchgeführt wurde. Wir verwendeten die Carrageenan-induzierten Pfotenödem- und die Essigsäure-induzierten Writhing-Techniken, um die entzündungshemmende bzw. schmerzstillende Wirksamkeit von Phytexponent in Schweizer Albino-Mäusen zu bestimmen. Die 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Testtechnik wurde verwendet, um die zytotoxischen Wirkungen von Phytexponent in vitro in der Vero E6-Zelllinie zu untersuchen. Phytexponent zeigte im Mausmodell mit Carrageenan-induziertem Pfotenödem eine signifikante (P < .05) entzündungshemmende Wirkung in Abhängigkeit von Dosis und Zeit. Die Wirksamkeit war bei 250 mg/kg Körpergewicht in der ersten, zweiten und dritten Stunde signifikant höher als bei Indomethacin (4 mg/kg Körpergewicht) (P < .05). Darüber hinaus reduzierte Phytexponent die durch Essigsäure induzierte Krümmungshäufigkeit bei Mäusen signifikant (P < .05), dosisabhängig, was seine analgetische Wirksamkeit zeigt. Bemerkenswerterweise zeigte Phytexponent (bei Dosen: 125 mg/kg KG und 250 mg/kg KG) eine signifikant höhere analgetische Wirksamkeit als Indomethacin (P < .05). Darüber hinaus war Phytexponent gegenüber Vero E6-Zellen (CC₅₀ > 1000 µg/ml) im Vergleich zu Cyclophosphamid (CC₅₀ = 2,48 µg/ml) nicht zytotoxisch. Somit weist Phytexponent in vivo eine signifikante entzündungshemmende und analgetische Wirksamkeit in Mäusemodellen auf und ist gegenüber der Vero E6-Zelllinie nicht zytotoxisch, was sein therapeutisches Potenzial nach weiteren empirischen Untersuchungen zeigt.

Schlüsselwörter: Carrageenan-induziertes Pfotenödem, Essigsäure-induziertes Krümmen, Vero E6-Zelllinie

Einführung

Eine Entzündung ist die Reaktion eines Gewebes auf schädliche Reize wie körperliche Verletzungen, Reizstoffe und Krankheitserreger. Sie ist durch eine erhöhte Gefäßdurchlässigkeit, Veränderungen des Blutflusses und die Migration von Leukozyten zu den betroffenen Stellen gekennzeichnet.¹ Schmerz bezeichnet ein unangenehmes emotionales und sensorisches Erlebnis, das durch Gewebeschäden entsteht und als Warnsignal vor weiteren Verletzungen dient.² Schmerzen, Fieber und Entzündungen stehen im Zusammenhang mit einer Vielzahl pathologischer Prozesse im Körper.³ Zur Behandlung von Entzündungen und Schmerzen stehen verschiedene entzündungshemmende und schmerzstillende Medikamente zur Verfügung;^4,5 allerdings sind sie insbesondere in einkommensschwachen und abgelegenen Gegenden unzugänglich und unerschwinglich, sie sind wenig wirksam und verursachen Nebenwirkungen mit lebensbedrohlichen Folgen.^6,7 In diesem Zusammenhang hat sich der Schwerpunkt auf die Untersuchung von Naturprodukten, insbesondere Heilpflanzen, als eines der vielversprechendsten Therapeutika für entzündliche Erkrankungen verlagert.⁸

Forschungsdaten zeigen, dass pflanzliche Naturprodukte eine wichtige Rolle bei der zukünftigen Arzneimittelforschung spielen, insbesondere bei der Behandlung von Entzündungen und Schmerzen.^9–11 Dies ist ermutigend, wenn man bedenkt, dass über 80 % der Bevölkerung in den Ländern der Dritten Welt, insbesondere in Afrika, für ihre Gesundheitsversorgung auf traditionelle Medizin angewiesen sind.¹² In Kenia behandeln verschiedene Gemeinschaften Schmerzen, Fieber und Entzündungen mit pflanzlichen Heilmitteln im Rahmen ihrer traditionellen und komplementären Medizin.^13–19

Obwohl Heilpflanzen in der alternativen und ergänzenden Therapie seit langem umfassend eingesetzt werden, wurden verschiedene Bedenken hinsichtlich ihrer Sicherheit geäußert.²⁰ So fehlen beispielsweise in den meisten Ländern gesetzliche Richtlinien für die Ausübung traditioneller Medizin, was skrupellosen Praktikern große Chancen bietet.²¹ Darüber hinaus gibt es nur wenige Daten zu Dosierungsschemata, Wechselwirkungen zwischen Kräutern und Kräutern sowie zwischen Medikamenten und den damit verbundenen Wirkungen, um eine wirksame Verschreibung zu ermöglichen.²² Darüber hinaus schmälert der Mangel an empirischen Daten zu den Sicherheits- und Toxizitätsprofilen vieler Heilpflanzen das Vertrauen in die Kräutermedizin noch weiter. Daher ist es zwingend erforderlich, die Toxizität und Sicherheit von Kräuterpräparaten zur Behandlung verschiedener Krankheiten zu bewerten, um die Entwicklung unerwünschter Wirkungen und Todesfälle zu verhindern.^20,22

Der Phytexponent wird in Kenia und vielen anderen Ländern in der Komplementär- und Alternativmedizin zur Behandlung von Entzündungen, Schmerzen und den damit verbundenen Syndromen mit beachtlicher Wirksamkeit eingesetzt. Einige der zur Herstellung des Phytexponenten verwendeten Pflanzen werden in der traditionellen Medizin eingesetzt, da sie über vielfältige pharmakologische Wirkungen gegen verschiedene Krankheitsbilder verfügen. So werden beispielsweise Extrakte des Dreifarbigen Veilchens traditionell zur Behandlung von entzündlichen Lungenerkrankungen und Hautkrankheiten wie Geschwüren, Juckreiz, Schorf, Schuppenflechte und Ekzemen eingesetzt.²³ Darüber hinaus wird Echinacea purpurea häufig zur Linderung von Erkältungssymptomen eingesetzt und besitzt nachweislich entzündungshemmende und immunstimulierende Eigenschaften.²³ Darüber hinaus wird Allium sativum (Knoblauch) häufig als Nahrungsmittelzutat verwendet und die über 200 Phytochemikalien werden zur Behandlung verschiedener entzündungsbedingter Erkrankungen, darunter einiger Krebsarten, und als Aphrodisiakum eingesetzt.²³

Kürzlich haben Moriasi et al.²⁴ signifikante in vitro entzündungshemmende und antioxidative Aktivitäten sowie das Vorhandensein bioaktiver Phytochemikalien mit vielfältigen pharmakologischen Wirkungen, einschließlich entzündungshemmender und antioxidativer Wirkung, gezeigt. Es gibt jedoch nur wenige dokumentierte Studien zur in vivo-Wirksamkeit dieses Polykräuterprodukts, seiner Wirkungsweise(n) bei verschiedenen Krankheitszuständen, seiner Toxizität und Sicherheit.

Daher wurde diese Studie konzipiert, um die in vivo entzündungshemmenden, schmerzstillenden und zytotoxischen Wirkungen der Phytexponent-Formulierung aus Viola tricolor, Echinacea purpurea, Allium sativum, Matricaria chamomilla und Triticum repens zu untersuchen, als potenzielle alternative Quelle für erschwingliche, zugängliche, wirksame und sichere schmerzstillende und entzündungshemmende Leitsubstanzen für die Arzneimittelforschung und -entwicklung.

Materialen und Methoden

Die Quelle der Phytexponent-Polyherbal-Formulierung
Die Phytexponent-Formulierung (Pharmapath 27, Belgien; Chargennummer: 17E19) wurde von einem lokalen Anbieter gekauft und gemäß den Richtlinien des Herstellers bei Raumtemperatur gelagert und nur bei Bedarf entnommen.

Versuchstiere
Für diese Studie wurden Schweizer Albino-Mäuse mit einem Gewicht von 24 ± 1 g und einem Alter zwischen vier und fünf Wochen verwendet. Die Versuchstiere wurden unter Standardbedingungen (Temperatur: 25 ± 2 °C; relative Luftfeuchtigkeit: 55–61 %; 12 Stunden Dunkelheit und 12 Stunden Lichtzyklus) in rechteckigen Käfigen aus Polypropylen mit den Abmessungen 30 cm × 20 cm × 13 cm untergebracht, in denen weiche Holzspäne als Einstreumaterial verwendet wurden. Die Mäuse wurden nach Belieben mit Standard-Laborfutter für Nagetiere (Pellets) und sauberem Wasser gefüttert und in einem natürlichen Tag-Nacht-Rhythmus gehalten. Die Versuchsmäuse wurden 72 Stunden vor Versuchsbeginn an die Laborbedingungen gewöhnt.

Bestimmung der in vivo entzündungshemmenden Wirkung des Phytexponentenpräparats
Die Carrageenan-induzierte Pfotenödem-Technik von Winter et al.²⁵ wurde mit geringfügigen Modifikationen übernommen, um die entzündungshemmende Wirkung des Phytexponenten zu untersuchen. Kurz gesagt wurden Versuchsmäuse nach dem Zufallsprinzip in 8 Gruppen mit jeweils 5 Mäusen aufgeteilt. Den Mäusen der normalen Kontrollgruppe [A] wurden oral 10 ml/kg KG physiologische Kochsalzlösung verabreicht. Den Mäusen der negativen Kontrollgruppe [B] wurde oral physiologische Kochsalzlösung (10 ml/kg KG) verabreicht und nach 30 Minuten wurden ihnen 100 µl 1 %iges Carrageen (Sigma-Aldrich, Deutschland) subplantar in die rechte Hinterpfote (sp) injiziert. Die Mäuse der positiven Kontrollgruppe [C] erhielten oral 10 mg/kg KG Indomethacin und nach 30 Minuten 100 µl 1 %iges Carrageen subplantar in die rechte Hinterpfote. Mäuse in anderen Versuchsgruppen (D–H) wurden oral mit Phytexponent in Dosierungen von 15,625 mg/kg KG, 31,25 mg/kg KG, 62,5 mg/kg KG, 125 mg/kg KG, 250 mg/kg KG bzw. 500 mg/kg KG behandelt und nach 30 Minuten subplantar mit 100 µl 1 %igem Carrageen injiziert. Die Veränderungen des Pfotendurchmessers wurden vor der Entzündungsinduktion sowie 1 Stunde, 2 Stunden, 3 Stunden und 4 Stunden nach der Entzündungsinduktion mithilfe einer plethysmographischen Technik gemessen und die prozentuale Entzündungshemmung berechnet und tabellarisch dargestellt.

Bestimmung der analgetischen Wirkung des Phytexponenten
Die analgetische Aktivität des Phytexponenten wurde gemäß der von Koster et al.²⁶ beschriebenen Methode bewertet, mit leichten Modifikationen. Kurz gesagt, die Mäuse der normalen Kontrollgruppe [A] erhielten nur physiologische Kochsalzlösung (10 mg/kg KG; p.o.). Den Mäusen der negativen Kontrollgruppe [B] wurde nach 30 Minuten oral physiologische Kochsalzlösung in einer Dosis von 10 mg/kg KG (p.o.) und 100 µl Essigsäure (0,6 % w/v; i.p.) verabreicht (Chargen-Nr. L148661503; Loba Chemie). Andererseits erhielten die Mäuse der positiven Kontrollgruppe [C] nach 30 Minuten Indomethacin (4 mg/kg KG; p.o.) und 100 µl Essigsäure (0,6 % w/v; i.p.). Darüber hinaus wurde den Mäusen in anderen Versuchsgruppen [D–H] Phytexponent in Dosierungen von 15,625 mg/kg KG, 31,25 mg/kg KG, 62,5 mg/kg KG, 125 mg/kg KG, 250 mg/kg KG bzw. 500 mg/kg KG oral verabreicht, jeweils 30 Minuten vor der intraperitonealen Injektion von 100 µl 0,6 %iger Essigsäure. Die Gesamtzahl der Krümmungen wurde für jede Versuchsmaus nach 5-minütiger Krümmungsinduktion für 15 Minuten aufgezeichnet und als prozentuale Hemmung der Krümmung ausgedrückt.

In-vitro-Zytotoxizitätstest

Vero E6-Zelllinienkultur
Die normale Nierenepithelzelllinie der Afrikanischen Grünen Meerkatze (Vero E6) wurde von der American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, USA) bezogen. Die Vero-Zelllinie (Vero E6) wurde in T75-Kulturflaschen mit Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) (ATCC® 30-2003) kultiviert (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), in einer aseptischen Umgebung zur Vermeidung von Kontamination und ergänzt mit Penicillin (100 Einheiten/ml)-Streptomycin (100 µg/ml) sowie 10 % fötalem Rinderserum (10 % FBS) (Bio Whittaker®, Verviers, Belgien). Die Kultur wurde bei 37 °C in einem Inkubator (SHEL LAB™, Sheldon Mfg., Inc., OR, USA) mit 5 % CO₂ in der Luft und 65 % Luftfeuchtigkeit inkubiert. Das Zellwachstum wurde dreimal wöchentlich kontrolliert (Montag, Mittwoch, Freitag), trypsiniert und gemäß dem modifizierten Verfahren von Bibi et al. passagiert.²⁷

Bestimmung der Auswirkungen des Phytexponenten auf die Zelllebensfähigkeit
Die Standard-MTT-Testtechnik^27,28 wurde verwendet, um die Lebensfähigkeit von Vero E6-Zellen in Anwesenheit und Abwesenheit des Phytexponenten zu bestimmen. Für diesen Test wurden 100 µl des Wachstumsmediums in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte gegeben und anschließend mit 20.000 Vero E6-Zellen besiedelt. Die Zellen konnten sich über Nacht anheften. Verschiedene Konzentrationen des Phytexponenten und Cyclophosphamid (positive Kontrolle) wurden gemäß Testprotokoll in dreifacher Ausfertigung in die jeweiligen Vertiefungen gegeben. Anschließend wurden die Multiwell-Platten 48 Stunden bei 37 °C, 5 % CO₂ und 95 % relativer Luftfeuchtigkeit inkubiert.

Nach der Kultivierung wurden 10 µl frisch zubereitetes MTT-Reagenz zu jeder Vertiefung hinzugefügt und die Platten weitere 4 Stunden inkubiert. Mithilfe einer Mikropipette wurden die jeweiligen Überstände abgesaugt, gefolgt von der Zugabe von 100 µl Dimethylsulfoxid (DMSO), um die MTT-Kristalle zu solubilisieren. Die Platten wurden dann geschüttelt und die optische Dichte jeder Vertiefung wurde mit einem ELISA-Scanning-Multiwell-Spektrophotometer (Multiskan Ex lab-systems) bei 562 nm gemessen. Die prozentuale Hemmung der Zellproliferation (prozentuale Zytotoxizität) wurde mit folgender Formel berechnet:

%Cytotoxicity = 1 − ( OD_treated / OD_control ) × 100

(nach Fatemeh & Khosro).²⁹

Datenmanagement und statistische Analyse

Die erhaltenen Daten wurden zunächst in einer Excel-Tabelle (Microsoft 365) tabellarisch dargestellt und anschließend zur Analyse in GraphPad Prism Version 9.2 exportiert. Die Daten wurden einer deskriptiven Statistik unterzogen und die Ergebnisse als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (x̄ ± SEM) unabhängiger Replikationsexperimente ausgedrückt. Anschließend wurden eine univariate Varianzanalyse (ANOVA) oder eine zweiivariate Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt, um signifikante Unterschiede zwischen den Mittelwerten der unabhängigen Behandlungsgruppen zu ermitteln. Danach erfolgte Tukeys Post-hoc-Test für paarweise Vergleiche und Mittelwerttrennungen bei α = 0,05. Ein ungepaarter Student-t-Test wurde durchgeführt, um die zytotoxischen Wirkungen des Phytexponenten und von Cyclophosphamid mit einem Konfidenzniveau von 95 % zu vergleichen.

Ergebnisse

Entzündungshemmende Wirkung des Phytexponenten bei Schweizer Albino-Mäusen
Der Phytexponent zeigte im Mausmodell mit Carrageenan-induziertem Pfotenödem eine signifikante (P < 0,05) entzündungshemmende Wirkung in Abhängigkeit von der Zeit (Tabelle 1). Bei einer Dosis von 31,25 mg/kg Körpergewicht betrug die prozentuale Entzündungshemmung durch den Phytexponenten in der ersten Stunde 1,117 ± 0,193 %, in der vierten Stunde hingegen 11,162 ± 0,091 % (P < 0,05). Bei einer Dosis von 62,50 mg/kg Körpergewicht lag die prozentuale Entzündungshemmung zwischen 6,240 ± 0,242 % in der ersten Stunde und 17,407 ± 0,186 % in der vierten Stunde (P < 0,05). Die prozentuale Entzündungshemmung durch Phytexponent bei einer Dosis von 125 mg/kg Körpergewicht lag zwischen 9,645 ± 0,020 % in der ersten Stunde und 31,795 ± 0,090 % in der vierten Stunde (P < 0,05). Bei einer Dosis von 250 mg/kg Körpergewicht lag die prozentuale Entzündungshemmung durch Phytexponent zwischen 14,000 ± 0,102 % in der ersten Stunde und 37,931 ± 0,133 % in der vierten Stunde (P < 0,05). Bemerkenswert ist, dass die Phytexponent-Formulierung die Entzündung dosis- und zeitabhängig signifikant hemmte (P < .05).